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寡核苷酸药物合成及其杂质分析

TIME:2024-11-13

寡核苷酸是一种通过固相合成法生产的新兴药物。作为一种化学物质，它们具有独特的产品相关杂质和降解物，其表征是药物开发的必要步骤。

近年来由于核酸修饰和递送载体的突破，带来了变革性疗法的创新浪潮，其中被认为是继小分子药物、抗体药物之后第三代创新药物的核酸药物迎来了爆发式增长，其优势在于广泛的可成药靶点、特异性强、安全性高、效果持久、开发成功率高和制造成本低等。

寡核酸药物是由20-60个核苷酸单元组成的单链或双链结构，通过作用于mRNA来调控疾病基因转录翻译，抑制基因表达，主要有反义寡核苷酸（ASOs)，小干扰RNA（siRNA）和微小RNA（miRNA）。

1、寡核苷酸的固相合成

基于固相亚磷酰胺化学法，该方法通过将核酸固定在固相载体上，通过脱保护、偶联、氧化和加帽四步循环，每个循环连接上一个新的核苷酸，直至寡核苷酸链延伸至所需长度。具体步骤如下：

脱保护

使用溶解在二氯甲烷/甲苯中的2-3%三氯乙酸（TCA）或二氯乙酸（DCA）移除核糖5'的DMT基团，暴露5'-OH，以供下一步偶联。

偶联

将亚磷酰胺保护的核苷酸单体与四氮唑活化剂混合并进入合成柱，形成亚磷酰胺四唑活性中间体。亚磷酰胺四唑活性中间体遇到载体上已脱保护基的核苷酸时，将与其5'-羟基发生亲核反应，缩合并脱去四唑，此时合成的寡核苷酸链向前延长一个碱基。

氧化/硫代

偶联反应时核苷酸单体是通过亚磷酯键（磷为三价）与连在载体上的寡核苷酸连接，而亚磷酯键不稳定，易被酸、碱水解。因此需要被氧化剂氧化成稳定的五价的磷。

加帽

偶联反应后为了防止连在载体上的未参与反应的5'-OH在随后的循环反应中被延伸，通常使用两种试剂（盖帽剂A：醋酸酐和盖帽剂B：N-甲基咪唑，酰化反应的催化剂）来酰化5'-OH。

经过以上四个步骤后，一个脱氧核苷酸被连接到固相载体的核苷酸上。

2、寡核苷酸固相合成中杂质

在寡核苷酸的固相合成过程中，产生的杂质种类多样，包括寡聚物（短核苷酸N-x/长核苷酸N+x）、修饰反应的副产物、脱保护基不完全产物、缺失嘌呤碱基的寡核苷酸以及其他降解产物等。下文对各步骤可能产生杂质做简单介绍。

去甲基化

DCA溶液，在二氯甲烷或甲苯中，可能含有微量三氯乙醛（氯醛）。三氯乙醛与寡核苷酸的末端游离羟基反应形成半缩醛，与新加入的单体反应，生成质量比全长产物（FLP）高147Da的寡核苷酸杂质。

↑二氯乙酸中存在的氯醛在脱甲基化过程中发生反应形成比全长产物（FLP）高147Da的杂质。

脱保护时间取决于流速和柱子尺寸，反应时间不够/脱保护剂酸性太弱会产生N-1杂质

反应时间太长/脱保护剂酸性太强则导致脱嘌呤的产生。

↑在酸性条件下进行去嘌呤化的机理

偶联

活化剂四唑提供一个质子给亚磷酰胺单体3'磷酸上二异丙胺基上的氮原子，质子化的二异丙胺是一个良好的离去基团，与四唑形成亚磷酰胺四唑。N-1杂质是偶联中最常见的杂质，它们的偶联效率低于100%。N+1杂质的形成由于活化剂四唑的弱酸性能移除一部分亚磷酰胺单体的DMT基团。新加入的亚磷酰胺单体自身形成二聚体，随后与脱保护的5'-OH反应可能导致N+1杂质产生；新加入的亚磷酰胺单体被偶联两次也会导致N+1杂质产生。

氧化/硫代

不完全氧化/硫化会导致两种DMTr-磷酸盐杂质，在随后的脱甲基化过程中产生的DMTr阳离子可以与亚磷酸盐三酯中间体反应，形成含有对酸稳定的DMTr基团的寡核苷酸。一种杂质比N-1多366Da，另外一种杂质比FLP多286Da。另外，氧化试剂可以将已形成的PS键氧化为PO键，得到比FLP少16Da的杂质。