近年来，外泌体作为一种天然的纳米级物质传递载体，在细胞间通讯中扮演着至关重要的角色。外泌体蕴含着丰富的生物信号物质，在疾病诊断、治疗和药物递送等方面展现出了巨大的应用潜力。本文将带您深入了解外泌体的基本概念、作用原理、应用场景、制备工艺及挑战，并结合实例展现英赛斯能为您提供的助力。
外泌体是细胞分泌的大小约为30-150nm的纳米物质，属于细胞外囊泡的一种。它们具有类似细胞的结构，磷脂双分子层表面镶嵌着多种特异性膜蛋白，内部搭载着蛋白质、RNA、DNA等重要生物信号物质。外泌体广泛分布于血液、尿液、脑脊液、唾液、乳汁、胆汁等各种体液中，几乎所有细胞在正常生理状态或受到外界刺激时，都能分泌这类具有膜结构的囊泡。
图1：外泌体结构示意图（来源：Yu D,Li Y,Wang M, et al. Exosomes as a newfrontier of cancer liquid biopsy. Mol Cancer. 2022:21(1):56. ）
外泌体的形成起始于细胞质膜内陷形成的分泌内体，细胞溶质蛋白、核酸和脂质等被选择性地包裹在外泌体中，使其能够继承亲本细胞的许多特定生物分子。这种特性使得外泌体在细胞间通讯中发挥着重要作用，通过表面分子与其他细胞受体靶向结合，将内含物传递至受体细胞，引起相应的功能改变。
外泌体的独特结构和功能使其在多个领域展现出广泛的应用前景：
外泌体携带的物质与其来源的细胞密切相关，这种异质性为疾病的诊断与监测提供了可能。例如，肿瘤细胞来源的外泌体在肿瘤发生的分子机制、诊断和治疗中发挥重要作用，已证明能促进癌细胞的迁移及侵袭，增加肿瘤转移的风险。
外泌体作为载体综合了细胞药物递送和纳米技术的优势，具有生物相容性好、免疫原性低、几乎无毒性等特点。它们能够跨越血脑屏障、胎盘屏障等生物屏障，实现复杂系统部位的递药。例如，在心血管疾病治疗中，间充质干细胞释放的外泌体能够发挥抗凋亡、抗炎和抗纤维化等作用，是MSCs移植治疗的关键机制。
外泌体作为药物递送载体，具有优异的稳定性和丰富的内含物，能够装载多种药物分子并精确靶向病变细胞。国家纳米科学中心聂广军团队使用细菌来源的外泌体作为mRNA递送平台，并通过基因工程进行表面修饰，试验结果表明这种外泌体载体能够显著抑制肿瘤进展，诱导长期免疫记忆，有望在mRNA疫苗中得到广泛应用。
英赛斯系列设备可以为您外泌体制备生产深度赋能。外泌体的制备工艺主要包括上游生产、外泌体分离和纯化、外泌体分析以及冻干外泌体等步骤。下面将结合实例进行详细说明。
上游生产主要用于外泌体制造的细胞系的培养和扩增。选择特定的细胞系进行传代培养和扩增，以产生大量用于外泌体生产的细胞。通常，规模化扩培可以使用生物反应器进行分批补料培养，细胞培养时采用无血清培养基，以减少污染并有助于外泌体纯化。
外泌体分离和纯化
当前外泌体的分离方法主要包括差速离心法、TFF切向流过滤法、密度梯度离心、空间排阻色谱法（SEC）、聚合物沉淀和复合层析等方法。为了提高外泌体的浓度和质量，超速离心、微滤法、空间排阻色谱（SEC）法和免疫亲和等技术多用于外泌体纯化。其中，TFF切向流过滤法和复合层析法是目前可供后续放大生产及稳定重复的较好工艺路线。
TFF切向流过滤法：
1. 处理过程：照顺序将中空纤维安装在切向流系统上，进端流速：100～130LMH，TMP：2～5 psi，剪切力：2000S-1～6000S-1。
在浓缩10～20倍后料液滤完后，开始换液，使用缓冲液换液，换液体积为浓缩后体积的6～8倍，之后收集浓缩系统所有液体至干净的离心管或者储液瓶内，此为初始浓缩液。顶洗：关闭透过端，向浓缩系统中加入与初始浓缩液等量的缓冲液，开始冲洗浓缩系统，冲洗2min。在将这部分冲洗液加入初始浓缩液中，混匀，记录浓缩液终体积或重量。
2. 英赛斯设备优势：AutoTFF配备先进的数据采集控制系统，能够实现与泵组模块、天平模块的数据交互，实时监控过滤过程中的各项参数；提供多种自动化的方法，如浓缩模块、透析模块等，可根据需求灵活选择，降低了人工干预的频率和操作难度；自动化和智能化的特点确保了过滤过程的稳定性和可靠性。
1. 处理过程：上样，将上一步浓缩产物接入层析系统，设置流速，0.2-0.5 CV/mL，开始上样，观察紫外吸收，待紫外吸收值为0~50 mAu时，开始收集流穿。平衡，样品上完后，使用缓冲液开始平衡层析柱，直至紫外吸收值为0~50 mAu，停止停止收样，如果紫外吸收在下降时出现拖尾，可以提前结束收样。
2. 设备优势：可以设置固定的方法，确保重现性和解放人力。自动化的系统。可以实时记录各项参数，确保数据完整性。
为了清楚了解外泌体的质量、大小、形态、特点，还需要对外泌体进行进一步分析研究。在外泌体表征中，通常会使用FACS流式细胞（FACS）多色分析、凝胶电泳Western blot（WB）、ELISA等标记分析和组织学分析。外泌体质量大小、形态分析主要使用的实验设备包括纳米粒度仪、透射电子显微镜（TEM）、纳米粒子跟踪分析仪（NTA）等。
虽然实验室中常规的外泌体存储条件为4℃、-20℃、-80℃，但外泌体存储在-80℃将不利于其运输及应用。采用外泌体冻干技术不仅可以在室温条件下稳定保存，还可以改善药物递送载体脂质体的长期稳定性。
外泌体的分离和纯化需要多步操作，工艺复杂且耗时。
外泌体的质量和浓度直接影响其应用效果，因此需要严格的质量控制。
如何实现外泌体的大规模生产，以满足临床应用需求，是当前面临的挑战之一。
外泌体作为细胞间通讯的重要媒介，在疾病诊断、治疗和药物递送等方面展现出巨大的应用潜力。随着生物技术的不断发展，外泌体制备工艺也在不断完善和优化。然而，外泌体制备工艺仍面临一些挑战，如制备工艺复杂、质量控制难度大以及规模化生产等问题。英赛斯NestoBR、NestoPure、AutoTFF等系列产品为外泌体上下游工艺开发提供了有利工具。同时英赛斯为客户提供强大的工艺开发支持，助力外泌体研发和生产企业优化工艺，提升效率和质量。
未来，随着技术的不断进步和创新，相信这些挑战将逐渐得到解决，外泌体将在更多领域发挥重要作用，为人类健康事业做出更大贡献。