核酸合成仪是一种专门为寡核苷酸合成而研发的设备,其主要组成部分有动力模块、检测模块、流路切换模块等。随着寡核苷酸药物的大热,核酸合成仪设备的市场需求量也随之增长。为了让用户更好理解核酸合成过程中各信号图谱,下面以AutoOligo系列核酸合成仪为例,介绍如何查看合成图谱,希望可以帮助用户更好的使用核酸合成仪。
寡核苷酸合成,每一个碱基分别由脱保护、偶联、氧化、盖帽四个步骤组成,整个核酸序列由3'至5'进行,直至完成最后一个碱基单体的合成,如下为合成流程图:
寡核苷酸合成图谱
核酸合成仪可以同时采集多种图谱曲线,分别为不同波长的紫外吸收(通常为350/260/400/411,具体同时检测波长个数需根据仪器配置进行确认)、电导、压力、系统流速、A泵流速、B泵流速,图一为寡核苷酸合成的完整图谱。
图一:寡核苷酸合成完整图谱
说明:
a. 碱基5'-OH有DMT保护,脱保护即脱除DMT的保护,游离后DMT在近紫外波长下可以被检测到有吸收值,以此计算脱保护效果和偶联效果,实际应用过程中使用较多的近紫外波长有350nm、400nm、411nm。
b. 正常的乙腈溶液无紫外吸收,当碱基单体溶解在乙腈中经过紫外流通池时,波长260nm有吸收值上传(不同碱基吸收数值不同),如遇无吸收值则很有可能是单体溶液的输送流路或单体配制存在问题。
c. 图一为一条16碱基的序列合成全过程。
寡核苷酸的合成是一个重复添加碱基单体合成的过程,下面将取其中一个碱基单体合成进行分析说明。
图二为合成单个单体全程图,图上显示横坐标为体积(可以在体积、柱体积和时间之间进行切换),纵坐标为UV350的吸收值(点击上方不同的曲线名称可进行切换),图中曲线分别为波长UV1 350、波长UV2 260、波长UV3 411、电导曲线、系统压力曲线、系统流速曲线、A泵流速曲线、B泵流速曲线、普通标、控制标。
为了方便对图谱进行解读,先介绍普通标和控制标,如图二中的G代表开始进行碱基单体G的合成,Detritylation代表脱保护开始,Det_Wash代表脱保护后的清洗,Coupling代表开始偶联步骤,Recycle代表偶联循环,Coupling_Wash代表偶联结束后的清洗,OX代表开始氧化步骤,CT_OX代表氧化反应,OX_Wash代表氧化结束后的清洗,CAP代表开始盖帽,CT_Cap代表盖帽反应,Cap_Wash代表盖帽结束后的清洗。
图二:单个单体全程图谱
脱保护过程中,选择一个波长对被二氯乙酸脱除的DMT进行检测,并通过积分来计算合成效率,一般选择的波长有350nm、400nm、411nm等。
波长监控意义:用于判断程序阶段运行是否正常。
可能问题分析:可以判断脱保护是否正常,氧化剂进样是否足够。
图三、图四分别列举了脱保护时350nm(蓝线)、411nm(粉红线)的吸收谱图,从普通标可以看出,脱保护和氧化阶段350nm(蓝线)、411nm(粉红线)的吸收谱图都很高,实际实验中,若发现这两条曲线出现异常则说明合成出现了问题。
图三:单个单体350nm图谱
图四:单个单体411nm图谱
图五是紫外260nm的谱图,需要注意的是在Recycle至Coupling_Wash阶段有一定的吸收值,实际实验中,如这一阶段的吸收值过低,则说明,此步骤的单体的输送可能存在问题,需要检查单体的流路是否正常。
图五:单个单体260nm图谱
电导监控意义:判断溶液输送是否正常。
可能问题分析:循环前push体积是否足够,为优化方法提供依据。
图六为电导图,一般Recycle标保持在电导曲线上升位置,若靠前或靠后则需要调整文本详情里coupling push的体积。
Recycle标后的电导趋势如图,应该是先波动在逐步趋于平衡,实际实验中若不是如此趋势,则需要注意是否为异常情况。
另外,氧化剂的电导通常曲线趋势如图一致,若氧化反应电导过低则表明可能存在异常情况。
图六:单个单体电导图谱
压力监控意义:判断程序与硬件是否正常。
可能问题分析:压力瞬时过高,可能为管路堵塞或反应柱筛板存在问题。
图七为合成单个单体的压力趋势图,图中可以看出,每一个Wash阶段,压力会有一个往上攀升的趋势,这是一个正常现象,除此,其他阶段压力偏差不大且基本为平衡状态。
图七:单个单体压力图谱
流速监控意义:判断流速是否正常。
可能问题分析:程序参数编辑错误。
图八、九、十为合成单个单体的流速趋势图,图中可以看出,每一个Wash阶段,流速会有一个往上攀升的趋势,这是一个正常现象,除此,其他阶段流速为一个固定数值。
图八:单个单体A泵流速图谱
图九:单个单体B泵流速图谱
图十:单个单体系统流速图谱
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